Elle effectue ses premières apparitions à l'écran dans les courts métrages Pain perdu en 1993, Enceinte ou lesbienne pour L'@mour est à réinventer en 1996, et interprète le personnage de Karine dans Les Sœurs Hamlet en 1998. En 2000, elle poursuit sa carrière grâce à des petits rôles dans La Captive et Passionnément. Elle connaît enfin la consécration grâce à Meilleur Espoir féminin de Gérard Jugnot. Sa prestation d'apprentie-comédienne lui vaut d'être sélectionnée au César du meilleur espoir féminin.
En 2001, Bérénice Bejo décroche le rôle de Christiana dans la production Hollywoodienne Chevalier de Brian Helgeland, incarnant la confidente de Shannyn Sossamon à l'écran. Elle partage durant quelques années la vie de l'acteur néo-zélandais Martin Henderson4.
En 2002, elle tourne en France aux côtés de Marie-France Pisier et Guillaume Depardieu dans Comme un avion.
En 2003, Bérénice Bejo est à l'affiche de 24 heures de la vie d'une femme de Laurent Bouhnik, où elle interprète Olivia, une jeune fille déroutant Michel Serrault par sa beauté et sa vitalité.
Tournant à deux reprises sous la direction de Steve Suissa, elle séduit tour à tour Stéphane Freiss et Titoff dans Le Grand Rôle (2004), une comédie sur le monde des acteurs, et Cavalcade (2005), un drame abordant le thème du handicap.
En 2006, elle effectue un retour en force en s'illustrant aux côtés de l'agent OSS 117, alias Jean Dujardin, dans OSS 117 : Le Caire, nid d'espions réalisé par Michel Hazanavicius. Il s'agit de la première collaboration du trio.
En 2007, elle fait une apparition dans le court métrage La Pomme d'Adam de Jerôme Genevray, avant d'incarner de petits rôles dans La Maison de Manuel Poirier et 13 m² de Barthélémy Grossman.
En 2008, elle apparaît au casting de deux comédies romantiques : Modern Love de Stéphane Kazandjian et Bouquet final de Michel Delgado. La même année, elle met au monde son premier enfant, fruit de sa relation avec le réalisateur Michel Hazanavicius, mettant ainsi sa carrière entre parenthèse pendant quelque temps.
En 2009, elle participe au documentaire de Serge Bromberg, L'Enfer. Le documentaire, reconstruit le film d'Henry George Clouzot en alternant image réelle, et scène de lecture entre Jacques Gamblin et Bérénice Béjo.
En 2011, elle apparaît au casting du film La Traque de Antoine Blossier aux côtés de Grégoire Colin. Ce film de genre a été tourné en 2009, mais n'a obtenu une sortie en salle qu'en 2011.
Elle retrouve Jean Dujardin dans le film muet et en noir et blanc The Artist réalisé par son compagnon, Michel Hazanavicius, qui ressuscite, entre pastiche et célébration, l'âge d'or du cinéma classique hollywoodien. Il connaît un grand succès critique et public (près de deux millions d'entrées) et est sélectionné au Festival de Cannes 2011 où Jean Dujardin reçoit un prix. Nommé, en janvier 2012, dans six catégories des Golden Globes, le long métrage gagne trois récompenses : meilleure comédie, meilleur acteur dans une comédie (Jean Dujardin) et meilleure musique originale (Ludovic Bource). Cité peu après douze fois aux BAFTA du cinéma britannique, The Artist obtient sept trophées dont ceux du meilleur film, du meilleur réalisateur (Michel Hazanavicius) et du meilleur acteur (Jean Dujardin).
En novembre 2011, elle rejoint le casting du film Populaire de Régis Roinsard, aux côtés de Romain Duris et Deborah François.
Après ses nominations successives, comme meilleur rôle secondaire, aux Golden Globes et aux SAG Awards puis comme meilleure actrice aux BAFTA, elle apprend, le 24 janvier 2012, qu'elle est également nommée aux Oscars en tant que meilleure actrice dans un second rôle pour The Artist.
Un mois après, elle reçoit le César de la meilleure actrice pour le rôle de Peppy Miller, la jeune étoile du cinéma parlant, amoureuse de la star déchue du muet George Valentin (Jean Dujardin), dans The Artist de Michel Hazanavicius. Au total, le film obtient six récompenses lors de la 37e cérémonie dont celles du meilleur film et du meilleur réalisateur pour son compagnon Michel Hazanavicius. The Artist est ensuite couronné par cinq Oscars à Hollywood, dont ceux du meilleur film, du meilleur réalisateur pour Michel Hazanavicius et du meilleur acteur pour Jean Dujardin.
Elle participera aux côtés d'Emir Kusturica au tournage de l'adaptation du roman Au bonheur des ogres de Daniel Pennac.