T.R. Knight déménage ensuite à New York, et joue sur les planches de Broadway. On le voit notamment dans Noises off (Silence en coulisses), aux côtés de Patti LuPone, puis il incarne Damis dans Tartuffe. En 2004, il fait partie du casting de la tragédie Boy. Pour son interprétation dans la pièce Scattergood off-Broadway, il obtient en 2003 une nomination aux Drama Desk Awards.
Il retrouve ensuite sa compagnie pour incarner le rôle-titre d'Amadeus. Parallèlement, il obtient quelques rôles à la télévision, dans l'éphémère série Charlie Lawrence, mais aussi dans Frasier, New York, section criminelle et Les Experts. En 2005, il décroche le rôle de George O'Malley dans la série Grey's Anatomy, et quitte la série à la fin de la saison 5.