Justin Chambers est né en 1970. Il est le fils de Pam et John Chambers et a deux frères et deux sœurs, dont un frère jumeau, Jason. Il a officié un temps comme mannequin dans les années 1990, notamment chez Calvin Klein (il est d'ailleurs l'égérie du parfum Contradiction), puis débute sa carrière de comédien à la télévision avec le rôle de Nick Terry dans le feuilleton Another World. Il interprète par la suite un délinquant juvénile dans Swift Justice, avant de tenir son premier rôle vedette dans la série Unis, un spin-off de New York Undercover. On l'a également vu dans deux téléfilms : Harvest of Fire et Rose Hill. Au cinéma, il effectue ses grands débuts dans Liberty Heights, comédie douce-amère de Barry Levinson située au cœur de l'Amérique ségrégationniste des années 50. Dans Un mariage trop parfait, il était Massimo, le promis finalement éconduit de Jennifer Lopez. Depuis 2005, il a fait quelques apparitions dans des séries telles que Cold Case. Chambers doit sa célébrité à son rôle du Dr Alex Karev dans la série Grey's Anatomy.