Natacha Régnier fait ses études au Collège Saint-Pierre d'Uccle, après la fin de ses humanités, elle passe une année à l'INSAS à Bruxelles, mais interrompt cette formation. On lui déconseille le métier d'actrice. Elle commence à tourner au début des années 1990 dans quelques courts métrages et fait la connaissance de Pascal Bonitzer. Après quelques difficultés à Paris et des seconds rôles, elle tourne le film Encore avec Bonitzer en 1996, en compagnie de Valeria Bruni-Tedeschi.
En 1998, c'est la percée longtemps attendue. Elle reçoit à Cannes le prix d'interprétation féminine pour le rôle de Marie Thomas dans La Vie rêvée des anges d'Erick Zonca puis avec Élodie Bouchez le prix de l'actrice européenne de l'année. Sur le tournage, elle rencontre aussi le compositeur Yann Tiersen (auteur de la bande originale du Fabuleux Destin d'Amélie Poulain) dont on peut entendre la chanson Rue des cascades dans la scène finale, de qui elle a une fille en 2002. Elle interprète des chansons dans son album L'Absente. Depuis 2008, elle est maman d'une autre fille avec Guillaume Bounaud.
En novembre 2005, le 19e festival du film de Brunswick (en Basse-Saxe, Allemagne) lui rend hommage en présentant huit de ses films. Son film Le Silence y a en outre été présenté à l'occasion du prix Heinrich décerné par le public.